Jika Anda tertarik pada biologi, terutama jika Anda mengajar mata pelajaran ini, maka artikel saya tentang persiapan dan pelaksanaan pekerjaan laboratorium untuk mengidentifikasi gen asing secara genetik dalam DNA makanan akan bermanfaat bagi Anda.
Kontroversi seputar GMO, serta gencarnya diskusi ilmiah dan etis tentang legalitas campur tangan manusia dalam "urusan Alam / Tuhan", akan diserahkan kepada para filsuf. Kami hanya menyatakan bahwa kompetensi profesional ahli biologi modern, ahli bioteknologi, bioinformatika dan genetika tidak dapat dibayangkan tanpa kemampuan untuk meneliti dan, jika perlu, mengubah gen. Sudah di sekolah, dan kemudian di universitas, eksperimen dan eksperimen bioteknologi mengharuskan siswa dan siswa untuk menetapkan tugas yang jelas, memahami metodologi eksperimental, dan kemampuan menganalisis data. Semua ini mengembangkan keingintahuan dan kepercayaan diri, dan menciptakan landasan untuk studi lebih lanjut tentang masalah dan masalah yang terkait dengan penelitian ilmiah. Saya RENCANA-CONSPECTberdasarkan 3 pengujian yang dilakukan dengan reagen BioRad dan peralatan standar yang diperlukan untuk analisis PCR. Tapi, tentu saja, KIT lain dapat digunakan untuk mendeteksi GMO. Semua nuansa eksperimen (protokol) dirinci dalam dokumentasi yang menyertai reagen, jadi saya tidak akan membahasnya secara terperinci. Jadi, garis besar rencana memiliki 2 nama: RENCANA - karena diperlukan untuk merencanakan isi pelajaran dengan jelas dan cermat, dan KONSPEKSI - karena perlu memikirkan terlebih dahulu materi apa yang akan diajarkan kepada anak-anak dan apa yang harus difokuskan untuk sepenuhnya mengungkapkan tujuan percobaan.
Rencana
Pengalaman dirancang untuk dua sesi.
Pelajaran satu:
1. Pengenalan teoritis siswa dengan dasar-dasar strategi deteksi GMO (target untuk deteksi dan identifikasi).
2. Isolasi DNA dari makanan (anak sekolah atau siswa membawa produk pilihannya).
3. Melaksanakan reaksi berantai polimerase.
Pelajaran kedua:
4. Elektroforesis gel dan diskusi.
5. Kata penutup dari guru.
Abstrak
Pelajaran pertama
1. Dari mana datangnya gen baru dan unsur pembantu (15-20 menit)
Organisme hasil rekayasa genetika adalah organisme yang memiliki kombinasi asing dari materi genetik yang diperoleh dengan menggunakan bioteknologi modern. Misalnya dengan menggunakan plasmid Ti, gen asing dan karakteristik tanaman hasil rekayasa genetika dapat berupa gen yang memberikan ketahanan terhadap herbisida (cp4, epsps, gox), ketahanan terhadap hama (cry), atau gen yang mengubah kualitas produk (PG, Bay TE). Untuk ekspresi gen asing dalam sel inang, diperlukan elemen genetik tambahan:
- promotor - urutan nukleotida yang dikenali oleh RNA polimerase sebagai penanda inisiasi transkripsi;
- ā , - ;
- - ā ( ), ;
- ā , , .
Desain plasmid juga mengandung gen kloroplas yang sangat terkonservasi dari Fotosistem II - bagian dari reaksi cahaya fotosintesis untuk memastikan bahwa DNA yang layak telah diekstraksi dan bahwa hasil GM negatif tidak terkait dengan matriks yang tidak dapat hidup.
Identifikasi DNA rekombinan pada pangan dapat dilakukan dengan beberapa cara, seperti pada Gambar 1.
Gambar 1. Identifikasi DNA rekombinan pada pangan
Kit reagen siap pakai yang paling umum digunakan untuk mengidentifikasi produk transgenik didasarkan pada identifikasi promotor dan terminator. Kit Penyelidik GMO BioRad menggunakan elektroforesis PCR dan DNA untuk memeriksa keberadaan dua urutan DNA berbeda yang terkait dengan GMO: promotor 35S dari virus mosaik kembang kol dan terminator gen sintase nopal dari Agrobacterium tumefaciens. Urutan DNA ini ditemukan di> 85% tanaman hasil rekayasa genetika yang dipasarkan di seluruh dunia. Gen baru yang ada dalam DNA kontrol positif adalah epsps. Sebagai kontrol integritas DNA tumbuhan yang diekstraksi dari makanan, PCR digunakan untuk memperkuat sebagian dari gen kloroplas fotosistem II yang umum pada sebagian besar tumbuhan tingkat tinggi. Jadi, tes ini menargetkan 3 target: promotor,terminator dan bagian dari gen kloroplas fotosistem II, masing-masing, dalam satu set 3 primer, dua di antaranya (primer promotor dan terminator) dicampur. Oleh karena itu, ada 2 botol dalam set: merah - primer transgenik, digunakan untuk menentukan apakah makanan mengandung transgenik, dan fotosistem II tumbuhan hijau, digunakan untuk menentukan apakah DNA telah diekstraksi dari bahan tumbuhan.
Setelah pidato pengantar, siswa harus dibiasakan dengan protokol untuk ekstraksi DNA dan PCR, selangkah demi selangkah menjelaskan jalannya percobaan dan fokus pada fitur bekerja dengan KIT dari produsen tertentu.
2. Isolasi DNA dari makanan (15-20 menit)
Bergantung pada pekerjaan yang tersedia, anak-anak dapat dibagi ke dalam kelompok yang terdiri dari 2-3 orang, masing-masing memilih produk makanan yang diinginkan untuk dianalisis. Keripik atau berondong jagung, yang sangat disukai anak-anak sekolah, diterima sebagai bahan penelitian, karena hampir semua kentang dan jagung yang menghasilkan camilan renyah membawa gen asing dan sangat mudah untuk mengidentifikasi GMO di dalamnya. Atau beri, misalnya stroberi, blueberry, roti dengan biji bunga matahari. Tetapi disarankan untuk menyetujui terlebih dahulu siapa yang akan menguji produk mana, karena KIT untuk ekstraksi DNA dirancang untuk produk tertentu dan, misalnya, yang digunakan dalam hal ini tidak menyiratkan isolasi DNA dari tepung, minyak, bumbu, serpihan jagung, dll.
Dalam percobaan yang telah saya jelaskan, DNA diisolasi dari blueberry, ketimun, dan biji bunga matahari.
Ciri-ciri khusus dari penelitian ini:
- Pra-penimbangan sampel (1 g) dan penggilingan menyeluruh dengan mortar. Penggilingan diperlukan untuk menghancurkan dinding sel tumbuhan yang agak padat (yang tidak dimiliki sel hewan).
- Isolasi dengan Matriks InstaGene yang dihomogenisasi (meskipun tentu saja deterjen dapat digunakan) tanpa penambahan protease (penghancuran protein seluler) dan tanpa pengendapan DNA dengan garam, karena garam sudah ada di dalam InstaGene.
- Tidak ada sorben di KIT, oleh karena itu, tanpa elusi - pada prinsipnya, anak-anak tidak dapat memperhatikan hal ini.
Mengapa InstaGene Matrix digunakan pada prinsipnya? Karena ini adalah cara yang cukup cepat untuk mengisolasi DNA - dalam 15-20 menit, yang secara signifikan menghemat waktu kelas. InstaGene juga mengkelat ion divalen (misalnya, Mg2), yang diperlukan untuk enzim yang menghancurkan DNA (misalnya, DNase).
3. Melaksanakan reaksi berantai polimerase
Setelah isolasi DNA yang berhasil dari makanan oleh anak-anak, sesuai dengan protokol produsen, campuran PCR disiapkan untuk 6 tabung Eppendorf sesuai dengan Tabel 1 (10-15 menit).
Menautkan
Setelah itu, bagian pertama percobaan berakhir. Guru menempatkan tabung di amplifier sendiri dan mengatur mode amplifikasi sesuai dengan protokol.
Pelajaran kedua
4. Elektroforesis gel dan diskusi (40-45 menit)
Anak-anak menyiapkan gel agarosa 3% dalam buffer TAE. Selama elektroforesis berlangsung (200 V 20 menit), Anda dapat mendiskusikan kemungkinan opsi untuk hasil (Gambar 2). Dan setelah menerima foto, diskusikan kemungkinan kesalahan.
Gambar 2. Hasil tes yang mungkin
Referensi
Misalnya, pada kelompok anak-anak yang menguji ketimun, tidak ada amplikon yang diamati (Gambar 3).
Gambar 3. Gambar gel elektroforesis sampel (mentimun)
ā - kontrol (- tidak mengandung GMO, + mengandung GMO); T - sampel uji; M - penanda berat molekul; PMM - primer fotosistem II; GMO adalah primer untuk GMO.
Pembahasan hasil 1 sampel:dalam hal ini, tidak ada primer yang ditambahkan ke campuran amplifikasi.
Pengalaman kedua adalah menguji DNA biji bunga matahari (Gambar 4).
Gambar 4. Gambar gel elektroforesis, sampel biji bunga matahari
ā - kontrol (- tidak mengandung GMO, + mengandung GMO); T - sampel uji; M - penanda berat molekul; PMM - primer fotosistem II; GMO adalah primer untuk GMO.
Pembahasan hasil sampel ke-2:kontrol negatif (kantong gel 2), yang genomnya tidak ada gen yang dimodifikasi, tidak mengandung amplikon. Hal ini menunjukkan bahwa primer tidak mengenali daerah sekuensing dari promotor 35S dan terminator NOS. Pola yang berlawanan dengan deteksi amplikon dari sekitar 200 pasangan basa diamati di kantong gel ke-6 (kontrol positif - kontrol yang dimodifikasi secara genetik). Secara visual, hanya satu produk amplifikasi dengan panjang sekitar 200 bp yang diperoleh pada transgenik kontrol positif (kantong gel 6), tetapi produk amplifikasi promotor dan terminator berukuran hampir sama (masing-masing 203 bp dan 225 bp (BioRad)), jadi bahwa kita dapat mengasumsikan bahwa ada dua produk amplifikasi di kantong gel 6.Dalam sebagian besar penelitian, promotor 35S dan terminator NOS adalah yang paling umum digunakan dan dapat digunakan untuk mendeteksi gen yang dimodifikasi di lebih dari 85% kasus. Metode ini cukup untuk menjawab pertanyaan apakah ada promotor dan / atau terminator di atas, tetapi metode ini tidak cukup untuk menjawab gen mana yang disisipkan.
Amplicon khusus untuk gen kloroplas fotosistem II dapat ditemukan di semua 3 sampel makanan (kantong 1, 3, 5), baik yang mengandung gen yang dimodifikasi maupun yang tidak mengandung gen yang dimodifikasi. Sampel yang diteliti tidak mengandung amplikon terminator NOS atau promotor 35S (kantong 4). Terlepas dari kenyataan bahwa percobaan berhasil dilakukan dan siswa mendapatkan hasil yang tidak ambigu, namun fotonya kurang jelas, seolah-olah mendung. Karena fenomena ini meluas ke seluruh gel, maka dapat disimpulkan bahwa kontaminasi terjadi selama pembuatan buffer TAE 1x. Itu mungkin barang pecah belah yang terkontaminasi di laboratorium.
Pengalaman terbaru sedang menguji blueberry (Gambar 5).
Gambar 5. Elektroforesis gambar gel sampel blueberry
ā - kontrol (- tidak mengandung GMO, + mengandung GMO); T - sampel uji; M - penanda berat molekul; PMM - primer fotosistem II; GMO adalah primer untuk GMO.
Pembahasan hasil 3 sampel: setelah gel dijalankan, gel agarosa dilihat dari atas ke bawah. Ketiga sampel makanan tersebut mengandung karakteristik amplikon dari gen kloroplas fotosistem II. Sebuah pita dapat dilihat pada kontrol negatif (dengan primer GMO), karena ini adalah kontrol bebas secara genetik, ini sangat aneh. Tidak ada amplikon dari sekitar 200 pasang basa yang diharapkan. 200 bp band juga muncul di sampel uji (blueberry) dan di kontrol positif. Ini menunjukkan bahwa primer mengenali situs pengurutan promotor 35S dari terminator NOS.
Namun mengapa pengujian sampel blueberry ternyata positif (hasil rekayasa genetika), hal ini mungkin disebabkan fakta bahwa blueberry adalah spesies tumbuhan transgenik alami.
Sampel yang diteliti kemungkinan merupakan contoh interferensi suatu organisme dengan organisme lain yang menggunakan bakteri tanah (tumefaciens). Salah satu contoh transfer transgenik alami dalam blueberry telah diidentifikasi oleh Tatyana Matveeva, Doktor Ilmu Biologi, Profesor di Institut Genetika dan Bioteknologi, Fakultas Biologi, Universitas Negeri St. Petersburg. Dia dan rekan-rekannya di institut tersebut menyusun katalog tanaman di seluruh dunia dengan genom yang sudah diurutkan. Dari 275 spesies tumbuhan yang diteliti, 23 adalah transgen alami. Termasuk kultivar kacang tanah, kultivar kenari, hop, buah jambu biji tropis, cengkeh, ceri Suriname, cranberry dan blueberry. (Matveeva, 2019).
Oleh karena itu, ada anggapan bahwa blueberry yang diteliti merupakan transgen alami.
5. 2
Tampaknya menjalankan PCR itu sederhana, tetapi pemecahan masalah bisa lebih sulit jika amplikon yang diinginkan tidak diperoleh atau jika muncul fragmen non-spesifik. Paling sering kita berbicara tentang barang pecah belah yang terkontaminasi di laboratorium. Untuk menghindari kontaminasi reagen dan pendekatan PCR, penggunaan ujung pipet baru harus dilakukan dengan hati-hati untuk setiap proses pemipetan. Selain itu, sebaiknya ganti sarung tangan lebih sering saat Anda bekerja. Selain itu, wadah dan larutan reaksi yang baru dan disterilkan harus selalu digunakan dan diberi label dengan benar untuk melacak kontaminasi dengan jelas. Ada banyak alasan mengapa PCR tidak berfungsi. Berbagai parameter kimia dan fisik harus diperhatikan untuk PCR yang sukses. Sayangnya, sangat sering terjadi setelah PCR tidak mungkin mendapatkan hasil yang diinginkan.
Karena jumlah DNA terkecil sekalipun dapat dideteksi oleh PCR, sangat penting untuk menghindari kontaminasi campuran reaksi PCR dengan produk PCR dari percobaan sebelumnya atau "DNA asing" dari sumber lain.
Hasil
Pengalaman mendeteksi GMO dalam makanan dimaksudkan untuk memperoleh keterampilan praktis dalam melakukan reaksi berantai polimerase. Terlepas dari kenyataan bahwa rencana sinopsis diusulkan, dirancang untuk 2 pelajaran, jeda di antaranya setidaknya satu hari, namun, skenario tipikal tetap menjadi kebijaksanaan guru. Bagian analitis dari studi ini dirancang untuk memandu peserta didik melalui proses menemukan dan memahami konsep yang relevan dengan prosedur dan analisis data di setiap tahap perjalanan. Diharapkan bahwa pendekatan ini (dibandingkan dengan guru yang memberikan semua informasi latar belakang kepada siswa) akan membuat keseluruhan pelajaran lebih dapat dimengerti oleh sejumlah besar siswa. Selama guru memiliki kesempatan untuk memeriksa kemajuan dan tingkat pemahaman masing-masing kelompok (selama 2 pelajaran),beberapa derajat kemandirian dimungkinkan jika diinginkan. Pendekatan ini memungkinkan lebih banyak pelajar untuk memperoleh keterampilan yang diinginkan seperti yang dijelaskan di atas.
Daftar literatur bekas:
- bio-rad, āwww.bio-rad.com,ā 03 Februari 2020. [Online]
- Matveeva T., Ottem L. (2019). Terjadinya transformasi genetik alami tanaman oleh Agrobacterium. Biologi Molekuler Tumbuhan, 101, 415-437. DOI: 10.1007 / s11103-019-00913-y