Sutra laba-laba dari bakteri fototrofik

Seperti yang telah kita ketahui sejak lama, alam merupakan sumber inspirasi yang sangat baik untuk banyak penelitian, penemuan, dan eksperimen. Burung dan serangga bersayap telah menunjukkan kepada kita bahwa langit cukup dapat dicapai, mamalia air telah menunjukkan kepada kita bagaimana memperpanjang masa tinggal kita di bawah air, dan laba-laba telah membuktikan bahwa bahkan makhluk terkecil pun dapat menciptakan sesuatu yang luar biasa. Dalam studi yang kami pertimbangkan hari ini, para ilmuwan dari Institut Penelitian Fisik dan Kimia (Wako, Jepang) telah menemukan cara untuk membuat jaring buatan menggunakan bakteri fototrofik. Bagaimana tepatnya mereka mencapai hal ini, seberapa alami jaring laba-laba yang dihasilkan, dan mengapa bakteri fototrofik digunakan? Jawaban atas pertanyaan ini dan pertanyaan lainnya menunggu kami dalam laporan para ilmuwan. Pergilah.

Dasar penelitian

Bagi banyak orang, laba-laba adalah "Ya Tuhan, singkirkan dia dariku!" atau "ugh, sungguh menjijikkan." Namun, dengan mengesampingkan fobia dan prasangka terhadap makhluk-makhluk ini, orang dapat mempertimbangkan betapa uniknya predator berkaki delapan ini. Anatomi laba-laba secara harfiah dibuat untuk perburuan yang sempurna. Di satu sisi terdapat racun yang dapat melumpuhkan bahkan membunuh mangsa atau musuh. Di sisi lain, ada organ indera yang berkembang dengan baik (terutama sentuhan karena trikobotria (rambut) di seluruh tubuh). Kartu kunjungan laba-laba, yang telah menjadi dasar banyak metafora dan slogan, adalah jaring mereka.





Video tentang bagaimana laba-laba menghasilkan jaring terkenal mereka.



Pada intinya, jaring adalah protein, yang komposisinya kaya glisin (C ₂ H ₅ NO ₂ ), alanin (NH ₂ -CH (CH ₃ ) -COOH) dan serin (HO ₂ C-CH (NH ₂ ) CH ₂ OH ). Sarang laba-laba terbentuk di kelenjar khusus, yang berbentuk cair.



Ketika sekresi kelenjar disekresikan melalui banyak tabung yang berputar, kutil laba-laba khusus membentuk benang darinya, yang digunakan laba-laba untuk membangun perangkap mematikannya.



Benang jaring laba-laba unik karena sifat mekaniknya lebih unggul dari banyak bahan lainnya. Misalnya, kekuatan tarik jaring laba-laba untuk laba-laba biasa ( Araneus diadematus ) adalah 1,1-2,7 GPa, untuk rambut manusia 0,25 GPa, dan untuk baja 0,4-1,5 GPa. Massa jenis sutra laba-laba 1/6 dari baja (1,3 g / cm ³ ). Artinya, jika Anda mengelilingi bumi dengan jaring, maka beratnya hanya akan menjadi 500 gram. Kepadatan energinya sekitar 1.2 × 108 J / m ³... Juga, sutra laba-laba sangat fleksibel, mis. dapat meregangkan hingga 5 kali panjang aslinya (dalam keadaan santai) tanpa jeda. Kekuatan tumbukan jaring laba-laba sebanding dengan benang polyaramida. Laba-laba bukanlah makhluk ekstrimofil, tetapi jaringnya dapat dengan mudah bertahan dari suhu -40 ° C hingga 220 ° C. Selain itu, sifat sutra yang biodegradable dan biokompatibel membuatnya cocok untuk aplikasi medis.





Perbandingan kekuatan tarik benang baja dan sutra laba-laba (kepadatan yang sesuai).



Juga mengherankan bahwa satu jenis laba-laba dapat menghasilkan beberapa jenis jaring yang memiliki sifat dan kegunaan yang berbeda (laba-laba spesies Argiope argentata menghasilkan sebanyak 5 varian jaring):

• untuk tepi luar dan bingkai web (sangat tahan lama);
• untuk area penangkapan mangsa (sangat lengket, elastis dan tahan lama);
• ( );
• ( 2 3 );
• ;
• .

Ini hanya gambaran singkat tentang sutera laba-laba, tetapi bahkan itu sudah cukup untuk memahami keunikan zat ini. Itulah sebabnya banyak ilmuwan telah mencoba untuk waktu yang lama untuk menciptakan padanan buatan dari web. Bagi banyak orang, ini cukup berhasil. Namun, masalah produksi massal masih belum terpecahkan.



Dalam pekerjaan yang kita pertimbangkan hari ini, para ilmuwan telah mengusulkan solusi untuk masalah ini. Ini terdiri dari penggunaan bakteri ungu Rhodovulum sulfidophilum , yang memiliki sifat fototrof * dan halofil * .

Fototrof * adalah organisme yang menggunakan cahaya untuk menghasilkan energi.

Halofil * adalah sejenis ekstremofil yang hidup dalam kondisi salinitas tinggi.

R. sulfidophilum adalah bakteri fotosintesis anoksigenik laut * dengan karakteristik metabolik berbeda yang menghasilkan biohidrogen, bioplastik dan asam nukleat ekstraseluler.

Fotosintesis anoksigenik * - tidak seperti fotosintesis konvensional, oksigen molekuler tidak terbentuk selama fotosintesis anoksigenik.

Tetapi keterampilan terpenting R. sulfidophilum bagi para ilmuwan adalah kemampuannya untuk tumbuh di bawah kondisi fotoautotrofik melalui penggunaan sumber daya yang murah dan terbarukan seperti cahaya (energi), CO ₂ (sumber karbon) dan N ₂ (sumber nitrogen) melalui proses fotosintesis dan fiksasi. nitrogen. Selain itu, R. sulfidophilum tumbuh subur di air laut, yang membantu mengurangi risiko kontaminasi biologis selama budidaya.



Dalam beberapa tahun terakhir, hasil yang baik telah dicapai dalam produksi massal spidroin (MaSp, protein sutera laba-laba) menggunakan organisme inang rekombinan ( bakteri Escherichia coli , ragi Pichia pastoris , ulat sutera).Bombyx mori , tembakau, kultur sel mamalia, dll.).



Penulis karya ini tidak menyangkal keberhasilan pendahulunya, tetapi perhatikan volume produksi yang sangat kecil dan biaya produk akhir yang agak tinggi karena tingginya biaya produksi itu sendiri (dalam kasus fermentasi mikroba, 70% dari biaya produksi adalah bahan mentah).



Dalam studi mereka, penulis mengusulkan metode baru untuk produksi sutra laba-laba yang ekonomis dan efisien menggunakan bakteri R. sulfidophilum , yang mampu menghasilkan urutan pengulangan hidrofobik MaSp1 (spidroin-1) menggunakan sejumlah kecil bahan organik dalam kondisi pertumbuhan fotoheterotrofik atau fotoautotrofik.

Hasil penelitian

Pertama, perlu menyiapkan bakteri R. sulfidophilum .



Kemungkinan memasukkan DNA plasmid eksogen ke dalam R. sulfidophilum melalui konjugasi bakteri * menggunakan plasmid yang diperoleh dari pCF1010 dan E. coli S17-1 sebagai strain donor telah dilaporkan sebelumnya .

Konjugasi * - transfer searah dari bagian materi genetik selama kontak langsung dua sel bakteri.

Dalam studi ini, diputuskan untuk menggunakan vektor berbeda (pBBR1MCS-2) yang mengandung gen resisten kanamisin, gen massa yang mengkode nuklease spesifik, dan sumber transfer ( oriT * ), yang banyak digunakan dalam konjugasi bakteri gram negatif.

oriT * adalah urutan pendek (hingga 500 bp) yang diperlukan untuk transfer DNA yang mengandungnya dari inang bakteri ke penerima selama konjugasi bakteri.

Dalam kromosom R. sulfidophilum (nomor aksesi NZ_CP015418), dua gen resistensi telurit yang mengkode protein resisten telurit dari keluarga TerB terdapat pada lokus A6W98_RS06280 dan A6W98_RS17070.



Sifat ketahanan terhadap kanamisin dan telurit digunakan sebagai penanda untuk pemilihan konjugan positif R. sulfidophilum .



Plasmid * pBBR1-Ptrc-MaSp1 mengandung:

• the * trc promoter (Ptrc), yang merupakan promotor konstitutif hibrida yang poten pada E. coli;
• urutan "AGGAGA" dari daerah pengikatan ribosom (RBS);
• MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).

* — , .

* — , - ( ).

Sekitar 0,4 g massa sel basah (CWM dari massa basah sel ) diperoleh dari 50 ml kultur R. sulfidophilum rekombinan yang ditanam hingga pertumbuhan stasioner dalam kondisi fotoeterotrofik, yaitu dari kaldu laut (MB dari kaldu laut ) dengan penerangan LED pada (730) nm, 20-30 W / m ² ) selama 4 hari.





Gambar # 1



Terlepas dari kenyataan bahwa ekspresi berlebih dari protein MaSp1 rekombinan tidak terdeteksi secara jelas di semua kultur rekombinan dari R. sulfidophilum menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida / SDSPAGE ( 1c), ekspresi positif protein MaSp1 dikonfirmasi dengan metode protein immunoblot untuk semua sel R. sulfidophilum rekombinan yang dibuat yang membawa pBBR1-Ptrc-MaSp1- (1-mer, 2-mer, 3-mer, atau 6-mer) ( 1d ).

K-measure * - urutan panjang k yang terkandung dalam urutan biologis.

Satu-satunya domain berulang dalam konstruksi yang dihasilkan mengandung 33 residu asam amino dari bentuk berikut:



NH ₂ -SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH.



Berat molekul teoritis dari protein target, termasuk sekuens nonsidroin (daerah pembelahan His-Tag, S-Tag, enterokinase dan trombin) pada N-terminus adalah 7,9 kDa untuk 1-mer (81 aa); 10,5 kDa untuk 2-mer (114 aa); 13,1 kDa untuk 3-mer (147 aa) dan 20,9 kDa untuk 6-mer (246 aa).

Ya - penunjukan unit massa Atom; kDa - kilodalton (1 kDa = 103 Da).



Alel dominan ditunjukkan dengan huruf kapital (A versus a). Karena setiap induk menyediakan satu alel, kombinasi berikut dimungkinkan: AA, Aa, dan aa.

Selain mengkonfirmasi ekspresi protein MaSp1, jumlah protein MaSp1 yang diperoleh dari kultur rekombinan R. sulfidophilum juga dinilai : ~ 3-10 mg / L (1-mer = 3,4 mg / L; 2-mer = 3,9 mg / L ; 3-mer = 10,2 mg / l; 6-mer = 6,8 mg / l) atau 3,5–6,9% dari total jumlah protein. Sebagai perbandingan, ekspresi heterolog dari spidroins dalam sistem rekombinan E. coli yang terkenal dan banyak digunakan hanya mampu menghasilkan ~ 0,3–1,2 mg / L spidroin murni.



Hasil yang paling mengejutkan, menurut para ilmuwan, dalam penelitian ini adalah demonstrasi pabrik sel mikroba berbasis organisme fotosintetik laut, di mana rezim pertumbuhan fotoautotrofik dapat diterapkan dengan menggunakan bahan baku nonpangan terbarukan dan air laut sebagai media kultur.



R. sulfidophilum , membawa pBBR1-Ptrc-MaSp1- (6-mer), dibudidayakan dalam air laut buatan (Daigo ASW dari air laut buatan) ketika diterangi oleh LED (730 nm, 20-30 W / m ² ) dengan garam bikarbonat (1 g / l) sebagai sumber karbon anorganik dan gas nitrogen (0,5 l / d) sebagai sumber nitrogen. Waktu budidaya adalah 7 hari ( 2a ).





Gambar No. 2



Unit penyusun terbesar, MaSp1- (6-mer), dipilih untuk percobaan selanjutnya karena berat molekul MaSp1 yang lebih tinggi akan menghasilkan kekuatan tarik yang lebih tinggi dari serat sutera laba-laba. Natrium bikarbonat telah digunakan untuk memasok karbon anorganik karena garam bikarbonat memiliki kelarutan yang lebih tinggi dan biaya transportasi yang lebih rendah daripada gas CO ₂ .



Peneliti sebelumnya telah melakukan percobaan untuk menentukan kondisi pencahayaan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel R. sulfidophilum : intensitas (8 dan 50 W / m ² ) dan panjang gelombang (730, 800 dan 850 nm). Studi ini mengevaluasi efek pertumbuhan dari rekombinan R.sulfidophilumbeberapa nutrisi tambahan (ekstrak ragi, vitamin, zat besi dan fosfor) yang kurang dalam media ASW.



Massa sel kering (CDM) menurun dari 0,90 g / L (dengan semua nutrisi) menjadi 0,66 g / L jika tidak ada ekstrak ragi dan menjadi 0,39 g / L jika tidak ada fosfor. Juga telah ditentukan bahwa rekombinan R. sulfidophilum tidak dapat tumbuh di ASW tanpa NaHCO ₃ , gas N ₂ , atau fosfor ( 2b ; ASW + N ₂ , ASW + C + N ₂ , ASW + C + P, dan ASW + P + N ₂ ).



CDM (~ 0,4 g / L) dalam varian medium ASW kemungkinan besar berasal dari inokulan *atau inokulum bahkan setelah sampel dicuci dengan 2% natrium klorida. Dengan demikian, sumber karbon, nitrogen, dan fosfor dibutuhkan untuk pertumbuhan R.sulfidophilum rekombinan dalam medium ASW.

Microbiological inoculant * - produk biologi yang mengandung kultur hidup mikroorganisme yang berguna bagi tanaman.

Seperti yang diharapkan, pertumbuhan sel meningkat secara signifikan dari 0,34 ± 0,02 g / L (ASW + C + N ₂ ) menjadi 0,58 ± 0,08 g / L (1,7 kali peningkatan) dan 0,81 ± 0,02 g / L (2,4 kali peningkatan) di hadapan ekstrak ragi (ASW + C + N ₂ + YE) dan fosfor (ASW + C + N ₂ + P), masing-masing.



CDM tertinggi dicapai dengan menambahkan ekstrak ragi dan fosfor, memberikan 1,04 ± 0,06 g / L (peningkatan 3,1 kali lipat).



Hasil ~ 0,2 mg / L protein rekombinan MaSp1 (2% dari jumlah total protein) diamati dalam kondisi ASW + N ₂ , ASW + C + N ₂ , ASW + C + P dan ASW + P + N ₂ ( 2c dan 2d). Produksi protein MaSp1 dibantu dengan penambahan ekstrak ragi, yang secara signifikan meningkatkan hasil protein MaSp1 dari 0,12 ± 0,10 mg / L (ASW + C + N ₂ ) menjadi 3,93 ± 2,76 mg / L (ASW + C + YE + N ₂ ).



Penambahan ragi juga meningkatkan persentase MaSp1 pada protein total dari 1.2 ± 1.0 menjadi 6.9 ± 5.3%. Menariknya, penambahan fosfor, sementara secara positif mempengaruhi peningkatan CDM, secara negatif mempengaruhi produksi protein MaSp1.



Dibandingkan dengan ASW + C + YE + N ₂ pada medium ASW + C + YE + P + N ₂ , yield protein MaSp1 menurun menjadi 2,71 ± 1,09 mg / L, dan persentase MaSp1 dalam protein total menurun menjadi 3,9 ± 1,6%.



Penjelasan untuk perbedaan produksi protein tergantung pada media kultur mungkin terletak pada fungsionalitas masing-masing komponen. Misalnya, ekstrak ragi terutama merupakan sumber nitrogen yang mendorong biosintesis protein. Sementara itu, fosfor adalah makronutrien dan hetero-elemen penting dalam banyak senyawa seluler penting, yang mendorong pertumbuhan produsen utama.



Untuk mendapatkan sutra laba-laba dalam bentuk biasanya, diperlukan pemurnian MaSp1.





Gambar # 3



Untuk mendapatkan protein MaSp1 yang cukup untuk ekstrusi serat, dilakukan fermentasi ( 3a ) untuk menghasilkan MaSp1- (6-mer).



Secara umum, ukuran spidroins berkorelasi positif dengan kekuatan tarik dengan berat molekul tertentu. Protein besar memiliki lebih banyak interaksi antar rantai dan antar rantai, lebih banyak keterikatan, dan lebih sedikit cacat akhir rantai.



Pemurnian MaSp1- (6-mer) dilakukan menggunakan kromatografi afinitas melalui tag histidin, yang terdapat pada N-terminus dari kaset gen MaSp1, dan kromatografi filtrasi gel. Hasilnya, ~ 10 mg MaSp1- (6-mer) ( 3b ) yang dimurnikan diperoleh dari ~ 40 g CWM.



Serat sutra dibuat dengan memipet 10 wt% murni MaSp1- (6 takaran) yang dilarutkan dalam hexafluoroisopropanol (HFIP) ke dalam bak koagulasi diikuti dengan penarikan manual dengan tang ( 3c). Hasil terbaik diperoleh dengan menggunakan 90% 2-propanol sebagai bak koagulasi, yang menyebabkan pengeringan yang relatif lembut, yang memungkinkan penarikan benang yang efisien. Analisis dengan pemindaian mikroskop elektron menunjukkan bahwa serat berdiameter 10-20 µm dan memiliki permukaan yang dilapisi dengan alur yang sejajar dengan sumbu serat. Fraktografi menunjukkan bahwa struktur internal terdiri dari mikrofibril ( 3d dan 3e ).



Untuk pengenalan yang lebih mendetail tentang nuansa penelitian ini, saya sarankan Anda melihat ke dalam laporan para ilmuwan dan bahan tambahan padanya.

Epilog

Dalam pekerjaan ini, para ilmuwan berbicara tentang keberhasilan pembuatan pabrik mikro untuk produksi protein MaSp1. Pemimpin utama produksi ini adalah bakteri R. sulfidophilum , berkat itu dimungkinkan untuk mencapai ekspresi fotoheterotrofik dari protein jaring laba-laba buatan dalam kondisi pertumbuhan fotoautotrofik.



Dengan kata lain, para ilmuwan telah memodifikasi bakteri secara genetik untuk menghasilkan sutera laba-laba, lebih khusus lagi protein MaSp1, yang merupakan komponen penting darinya. Selain manipulasi genetik, juga perlu menetapkan kondisi optimal untuk budidaya bakteri. Ternyata, lingkungan yang ideal adalah air laut buatan. Selain itu, gas nitrogen dan ekstrak ragi harus digunakan sebagai sumber nutrisi. Bersama-sama, konstituen ini mengarah pada pertumbuhan bakteri yang efisien dan karenanya menghasilkan protein jaring laba-laba.



Juga penting bahwa serat jaring laba-laba yang diperoleh dari protein memiliki struktur yang sangat mirip dengan serat alami yang dihasilkan laba-laba spesies Nefila .



Para ilmuwan mencatat bahwa metode mereka menumbuhkan protein sutera laba-laba dapat digunakan untuk menumbuhkan zat lain juga. Di masa mendatang, penulis studi berencana untuk meningkatkan pabrik mikro mereka untuk meningkatkan produksi protein dan meningkatkan karakteristik molekuler dari produk yang dihasilkan.



Menurut para ilmuwan, pekerjaan mereka dapat berkontribusi untuk memecahkan banyak masalah: krisis energi, air dan makanan, masalah dengan limbah padat, pemanasan global, dll. Alasan untuk berbagai kemungkinan ini adalah fakta bahwa pabrik-pabrik ini memproduksi bahan yang dapat terurai secara hayati dan biokompatibel menggunakan proses netral karbon.



Terima kasih atas perhatiannya, tetap penasaran dan semoga minggu kerja Anda bagus, guys. :)

Sedikit iklan

Terima kasih untuk tetap bersama kami. Apakah Anda menyukai artikel kami? Ingin melihat konten yang lebih menarik? Dukung kami dengan memesan atau merekomendasikan kepada teman, cloud VPS untuk pengembang mulai $ 4,99 , analog unik dari server level awal yang kami ciptakan untuk Anda: The Whole Truth About VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps dari $ 19 atau bagaimana membagi server dengan benar? (opsi tersedia dengan RAID1 dan RAID10, hingga 24 core dan hingga 40GB DDR4).



Apakah Dell R730xd 2x lebih murah di pusat data Equinix Tier IV di Amsterdam? Hanya kami yang memiliki 2 x Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 TV dari $ 199 di Belanda!Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - Dari $ 99! Baca tentang Bagaimana membangun infrastruktur bldg. sekelas dengan server Dell R730xd E5-2650 v4 dengan biaya € 9000 untuk satu sen?